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實(shí)驗(yàn)中的抗體應(yīng)用問題和解決方案

 更新時間:2024-05-16 點(diǎn)擊量:716

抗體是一種由漿細(xì)胞(效應(yīng)B細(xì)胞)分泌,被免疫系統(tǒng)用來鑒別與中和外來物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等的大型Y形蛋白質(zhì),僅被發(fā)現(xiàn)存在于脊椎動物的血液等體液中,及其B細(xì)胞的細(xì)胞膜表面。抗體能識別特定外來物的一個特征,該外來目標(biāo)被稱為抗原。
1. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎?
不一定能通用。流式是用直接標(biāo)記還是間接標(biāo)記?如果是直接標(biāo)記的話,那這個抗體一般不是FITC標(biāo)記或者就是TRITC,PE之類的。如果恰好你的免疫組化,也是想用熒光素標(biāo)記的抗體來直接標(biāo)記,那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標(biāo)記的話,或者是間接標(biāo)記的話,就有麻煩,因?yàn)闊晒馑氐臉?biāo)記很可能會影響二抗和一抗的結(jié)合。
2. 為什么我的抗體做WB非常好,而做不了IF,IHC等其他任何實(shí)驗(yàn)?
首先恭喜你有一個WB非常好的抗體,畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次,你這個抗體很可能是通過人工合成多肽得到的,和上面所述,你用來做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質(zhì)的中心,因此只能識別WB中線性的部分。
3. 如何選擇免疫組化抗體?
首先,一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體,單克隆抗體特異性強(qiáng),靈敏度低;多克隆抗體靈敏度高,特異性弱。根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,如果非特異多,那么選擇單克隆抗體;如果陽性信號弱,不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來源的都是多克隆,小鼠來源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識別什么種屬的抗原,抗體說明書上面一般注明有,比如小鼠Mus, 大鼠Rat, Hum。

再次比較重要的是要注意一抗的來源。比如我們在人的癌組織中做p53的免疫組化,一抗我們采用的是小鼠來源的p53抗體,那么二抗我們一定要選擇抗小鼠的二抗比如(山羊抗小鼠,兔抗小鼠),這一點(diǎn)非常重要。最后,一般的抗體說明書都會注明能做什么實(shí)驗(yàn),如果標(biāo)明了不可以做免疫組化,一定不要選擇;反過來說,即使標(biāo)明了可以做免疫組化,也不一定能夠做,商家只會夸大其效果。
4. WBIF的二抗是一樣的嗎?
很明顯,不是!免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗(yàn)的,是用FITCPE等標(biāo)記的抗體,結(jié)果需要紫外線激發(fā)并用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標(biāo)記的抗體,需顯色底物(OPDTMB)直接顯色(肉眼)或化學(xué)發(fā)光法顯影(需特殊儀器)
5. CHIP的抗體是否可以用來做WB抗體?
不一定,一般來說做CHIP級別的抗體對抗體純度特異性方面都要求比較高,基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識別的是構(gòu)象表位(比如是由兩個實(shí)際靠在一起但變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)之后相隔很遠(yuǎn)的兩端序列),而不是線性表位,這種CHIP抗體做不了WB。
6. 抗體說明書上面沒有寫該抗體能夠用于某項(xiàng)實(shí)驗(yàn)怎么辦?
一般而言,抗體研發(fā)出來之后都要經(jīng)過WB,IPIF,IHC實(shí)驗(yàn)。檔發(fā)現(xiàn)濃度不夠做IFIHC時候,國外的抗體一般都是寫未檢測,國內(nèi)的抗體一般是不寫。所以盡量不要抱著試試的心里去嘗試,往往只會浪費(fèi)時間。你想啊,如果抗體能夠做該實(shí)驗(yàn),他們肯定會寫上去啊。
7. ELISA的抗體能否用來做WB?
通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000,IF/IHC1:100,而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個抗體用來做ELISA的,那么言外之意就是該抗體效價不高。但不是說ELISA的抗體不能用于做WB,抗體說明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000,那么你可以試試1:100做做WB。
通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000IF/IHC1:100,而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個抗體用來做ELISA的,那么言外之意就是該抗體效價不高。但不是說ELISA的抗體不能用于做WB,抗體說明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000,那么你可以試試1:100做做WB。

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