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MLPA試驗步驟

 更新時間:2024-08-12 點擊量:684


在上篇MLPA試驗原理中,我們已經(jīng)詳細介紹了MLPA技術。MLPA,即多重連接探針擴增技術,是一種分子生物學技術,用于檢測基因的拷貝數(shù)變異和序列變異。它結合了PCR(聚合酶鏈式反應)和連接酶技術,通過設計特定的探針來識別和擴增目標DNA序列。下面讓我們一起來看看MLPA試驗步驟吧!

MLPA試驗步驟分為六步:變性、雜交、連接、PCR擴增、片段分離、數(shù)據(jù)分析。

一、變性

DNA標本放入PCR儀中加熱5分鐘,使DNA雙鏈解鏈成單鏈。純化的樣本DNA被變性。

二、雜交

加入雜交反應液。雜交反應液包含SALSA MLPA探針混合液和SALSA MLPA緩沖液。每組MLPA探針混合物包含多達60對不同的MLPA探針,每個探針識別一個特異的靶序列。MLPA探針由兩部分組成:左探針和右探針寡核苷酸(LPORPO)。LPORPO包含PCR引物和DNA雜交序列。MLPA反應中,左探針寡核苷酸(LPO)和右探針寡核苷酸(RPO)都與靶序列進行雜交。

三、連接

實驗第二天,加入連接酶反應液。反應液包括連接酶緩沖液A,連接酶緩沖液BSALSA連接酶Ligase-65。連接酶Ligase-65結合到與靶序列雜交的左側探針和右側探針上,催化產(chǎn)生一個共價鍵。隨后,通過加熱反應液使連接酶失活,從而終止連接步驟。連接酶Ligase-65特異性非常高,只要雜交區(qū)域有一個核苷酸錯配,連接酶就不會連接兩段探針,使連接反應具有高度特異性。正是由于這種高特異性,MLPA也可以用于區(qū)分序列高度相似的假基因,以及檢測特定的點突變。

四、PCR擴增

加入PCR聚合酶混合液。PCR聚合酶混合液包含SALSA PCR聚合酶及SALSA PCR引物混合液。PCR引物混合液中包含dNTPs、正向引物和反向引物。正向PCR引物帶有熒光標記。所有連接上的MLPA探針均使用這對PCR引物進行指數(shù)擴增。PCR反應包含變性、引物復性以及引物延伸,循環(huán)35次。熒光標記被帶入到MLPA擴增產(chǎn)物,即MLPA擴增子中。

五、片段分離

擴增后,用毛細管電泳分離片段。毛細管電泳根據(jù)片段的長度進行分離,并將不同長度的片段顯示為峰值模式,稱為電泳圖。

六、數(shù)據(jù)分析

每個探針上的填充序列不同,每個擴增子都有不同的已知大小,因此在數(shù)據(jù)分析過程中可以對每個擴增子進行量化。毛細管電泳得到的數(shù)據(jù)將作為分析的輸入,輸入數(shù)據(jù)分析軟件Coffalyser。通過將每個樣本與一組參考樣本進行比較,我們可以得到一個探針比,這個探針比率將告訴我們一個基因有多少個拷貝數(shù)。由于大多數(shù)人類基因是二倍體,如果樣本有兩個拷貝,比例將為1.0,即樣本探針獲得的基因數(shù)量與參考樣本相同。如果比值為0.5,則該基因在個體中只有一個拷貝,這可能意味著目標基因的雜合缺失。另一方面,如果這個比率是1.5,那么很可能存在一個基因的雜合復制。



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